凝膠層析（gel chromatography）又稱分子篩過濾、排阻層析。凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時，由于它們的分子量不同而表現出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。凝膠層析可用于脫鹽、分離提純、測定高分子物質的分子量、高分子溶液的濃縮等，具有設備簡單，操作方便，分離迅速及不影響分子生物學活性等優點。
1. 溶脹
　　取所需干膠，用5倍去離子水溶脹，2小時后待用。
　　2. 裝柱
　　2.1 凝膠層析上樣、平衡和洗脫只用一種低鹽濃度的緩沖液；可選中性附近的Tris-鹽酸、PBS緩沖液。
　　2.2 將所取凝膠抽干，用初始緩沖液（按凝膠∶緩沖液=3∶1的比例）配成勻漿并脫氣。
　　2.3 將層析柱垂直固定，底端用水或緩沖液潤濕并保持一段液位。
　　2.4 用玻璃棒引導勻漿沿著柱內壁一次性倒入柱內，使凝膠在柱內自由沉降，水封層析柱，沉降過夜。
　　2.5 連結好柱子頂端活動柱頭，打開蠕動泵，讓緩沖液用使用時操作流速流過5柱體積，再使用1.5倍的操作流速流過5柱體積，調節適配柱頭，使其盡量貼近膠面，最后用2-3倍柱體積的緩沖液平衡柱子。
　　注意：凝膠過濾介質的使用對裝柱的要求較高，裝柱效果可用丙酮-水溶液進行等板高度的檢驗。所有操作過程不能引入氣泡，保證裝膠的均勻度。
　　3. 平衡
　　將平衡緩沖液以操作流速平衡層析柱，觀察檢測器的變化，直到電導、pH等參數不變。
　　4. 上樣
　　切換轉換閥進行上樣，上樣量應盡可能減小；樣品的預處理：除鹽，平衡液配制，0.45mm微孔濾膜過濾。
　　5. 洗脫
　　用緩沖液洗脫，保持流速不變。
　　6. 再生