IPTG誘導(dǎo)原理（原核表達(dá)）
乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因
IPTG誘導(dǎo)原理.
Lac阻遏物是一種具有4個(gè)相同亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白，都有一個(gè)與誘導(dǎo)劑結(jié)合的位點(diǎn)。在沒(méi)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)，Lac阻遏物（即下圖中的阻遏蛋白）能與操縱基因O結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，阻止了轉(zhuǎn)錄的路徑，從而抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。而當(dāng)有誘導(dǎo)劑（這里指IPTG）存在時(shí)，誘導(dǎo)劑可與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致阻遏物從操縱基因O上解離下來(lái)，RNA聚合酶不再受阻礙，啟動(dòng)子P開(kāi)始發(fā)生轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)反應(yīng)開(kāi)始發(fā)生轉(zhuǎn)錄。
、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)方法
原核表達(dá)鑒定詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟
拿到質(zhì)粒，離心（3000r/min；2min) 在質(zhì)粒中加入TE【使質(zhì)粒最終加入到110μL感受態(tài)細(xì)胞中的量為80-100ng，據(jù)此確定加入TE的量】，一般為(1μg質(zhì)粒加20μLTE；2μg質(zhì)粒加50μLTE；5μg質(zhì)粒加100μL TE) 將質(zhì)粒與TE混勻，吸取2μL混液與感受態(tài)細(xì)胞混勻 將感受態(tài)細(xì)胞放入冰箱（4℃）中，30min 取出后立即放入水浴鍋中（42℃），熱激90s, 再次放入冰箱（4℃）中，3min 拿出后取200μL的LB液體培養(yǎng)基加入到已轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞中 放入搖床（37℃; 195r) 中, 30nim至60min; (最佳45min) 取出離心（3000r/min；2min) 去掉200μL的上清，留100μL左右上清懸浮沉淀，吸取50μL懸液涂平板，【先將對(duì)應(yīng)抗性的平板放入培養(yǎng)箱（37℃）中預(yù)熱20min】 把平板放入培養(yǎng)箱（37℃），過(guò)夜（12h至16h）
每個(gè)平板挑取單菌落至4支對(duì)應(yīng)抗性的LB(4ml)試管中，編號(hào)為“0”“1”“2”“3” 將試管放入搖床（37℃；195r) 中，【單抗3h左右；雙抗4h左右；剛開(kāi)始用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)OD值；熟練后可目測(cè)（背光下，以試管中的槍頭為例，剛剛看不見(jiàn)槍頭即可）】，測(cè)OD值（0.6至0.8） 從“0”號(hào)管中取700μL懸液加入到100μL（C=80%）的保種甘油中，震勻，放入冰箱（-20℃）凍存 在每組菌的“1”“2”“3”號(hào)試管中分別加入2μL的IPTG【終濃度0.5mM最適，可根據(jù)日后表達(dá)摸索】 視不同的載體選擇適合的表達(dá)環(huán)境【PET/PGEX：15℃表達(dá)過(guò)夜；25℃表達(dá)6h；37℃表達(dá)3h至4h（4支試管，“0”“1”號(hào)試管15℃表達(dá)過(guò)夜；“2”“3”試管37℃表達(dá)3h至4h）。Pcold：【全部15℃表達(dá)過(guò)夜】
3.表達(dá)鑒定第三天，全菌的表達(dá)鑒定分析，注意控制溶質(zhì)的量及溶液黏度
從每組4支的試管中均取500μL菌液加入到1.5ml離心管中，【若OD值不一樣，值小的可多取】離心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀【沉淀少的，可再取菌液離心，盡量使沉淀量接近】 在每個(gè)離心管中加入500μL的DDH2O,懸浮沉淀，離心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀 在每支離心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer懸浮沉淀【當(dāng)溶質(zhì)適量且均一的情況下，加入量不變；當(dāng)溶質(zhì)多且粘稠時(shí)，應(yīng)使加入量增大，為降低粘度也可減少上液量】 放入煮樣器（100℃） 25min 取出后離心（6000r/min) 3min, 電泳檢測(cè)。 蛋白表達(dá)量不錯(cuò)，進(jìn)行蛋白純化.蛋白表達(dá)量低或者沒(méi)表達(dá)就菌株與質(zhì)粒、誘導(dǎo)條件、目的蛋白特性、培養(yǎng)環(huán)境及檢測(cè)環(huán)節(jié)五大類來(lái)進(jìn)行排查分析。
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