2022年3月以來，狡猾的奧密克戎變異毒株又一次打破了人們平靜的生活，全國各地陸續爆發新冠疫情，波及30個省（區、市）。  核酸檢測作為新冠疫情精準防控的有效手段，儼然已成為一種生活常態，“今天你核酸了嗎？  ”也轉變為人們的日常問候語。  說到這，大家了解核酸檢測中需要用到哪些核心原料嗎？  本文就來介紹一下核酸檢測中最關鍵的核心原料-酶。  

新冠核酸檢測流程

酶是一類極為重要的生物催化劑，具有催化高效性和反應特異性。絕大多數生化反應均需要酶的參與，核酸檢測也不例外。在新冠核酸檢測過程中（圖1所示），不同類型的分子酶在核酸檢測的不同實驗階段（核酸提取、RT-qPCR）發揮了重要的作用。 接下來，根據核酸檢測中的不同實驗環節為大家梳理核酸檢測過程中用到的核心酶原料。  

圖1.新冠核酸檢測流程

核酸提取過程中的核心酶

新冠病毒核酸提取過程主要包括裂解和純化兩大步驟： 

 裂解  是破壞樣品細胞結構，從而使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程；  

純化  則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質、鹽及其它雜質徹底分離，反應過程需要蛋白酶K（Proteinase K）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase I）及RNase抑制劑的參與。

蛋白酶K

蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，可切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵（圖2所示）。在核酸提取過程中，蛋白酶K可降解與核酸緊密結合的組蛋白，促進核酸的分離，使樣本核酸能更好的被提取。另外，蛋白酶K可降解RNA水解酶（RNase）活性，抑制RNase水解模板RNA。

圖2.蛋白酶K水解肽鍵示意圖

韻邦制藥蛋白酶K來源于基因重組酵母菌株，比活性≥30 U/mg蛋白，不含RNase和DNase，在尿素和SDS溶液中酶活性穩定存在，在較廣的pH范圍內（pH 4.0~12.0）均有活性，適用于原位雜交樣本制備，核酸純化等實驗中蛋白質的切割清除。  

脫氧核糖核酸酶Ⅰ

脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I）可催化多種形式DNA，靶向切割鄰近嘧啶的磷酸二酯鍵，產生5’端為磷酸基團、3’端為羥基的多聚核苷酸，平均消化產物最小為多聚四核苷酸。在新冠核酸提取過程中，DNase I主要用于除去RNA樣本中的基因組污染，避免RNA模板中存在DNA殘留，提高模板純度。 韻邦DNase I來源于重組E. coli菌株，不含RNase，可以用于各種RNA樣品的處理，最佳的工作pH范圍是7-8。在Mg  2+  存在下，DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；而在Mn  2+  存在的條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端或有1-2個核苷酸突出的粘末端（圖3所示）。

圖3.DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理圖

RNase抑制劑

在新冠核酸檢測過程中，樣本核酸的提取、純化或實驗的反應體系配制的過程中，均有可能引入核糖核酸酶（RNase）的污染，導致RNA模板被降解。若要避免RNase的污染，則需要RNase 抑制劑（RNase Inhibitor）發揮作用。 RNase Inhibitor是人的胎盤中存在的一種特異性RNase抑制劑，能夠特異地與RNase以非共價鍵結合形成復合體從而使RNase失活。韻邦鼠源RNase抑制劑Murine RNase Inhibitor（Cat#10603ES）不含人源蛋白中的兩個對氧化非常敏感的半胱氨酸，具有更高的抗氧化活性，能夠廣泛抑制各種類型RNase(RNase A, B, C)，更加適合于對高二硫蘇糖醇（DTT）敏感性的實驗如qPCR反應。

RT-qPCR過程中的核心酶

在完成新冠樣本核酸提取后，可通過RT-qPCR來完成核酸的檢測。在這些實驗過程中，DNA聚合酶、逆轉錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶都是必不可少的核心酶原料。

逆轉錄酶

提取純化后新冠病毒RNA，在進行qPCR反應前需先通過逆轉錄酶催化dNTP聚合（即RT-Reverse Transcription，逆轉錄反應），生成與模板RNA互補的cDNA序列（圖4）。對于RT-qPCR反應，應選擇可耐高溫的逆轉錄酶，目前市面上應用最廣泛的為MMLV逆轉錄酶，因其缺乏DNA內切酶活性且RNase H活性較低，在cDNA克隆應用中更有優勢。  

圖4.逆轉錄過程示意圖   

韻邦制藥第五代耐熱逆轉錄酶（Cat#11300ES）是通過基因工程技術得到的全新逆轉錄酶，熱穩定性好，可耐受高達60℃的反應溫度，適合具有復雜二級結構的RNA模板的逆轉錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉錄，可擴增長達10 kb的cDNA。

DNA聚合酶

完成模板逆轉錄過程生成雙鏈cDNA以后，就需要PCR反應中的“靈魂選手”DNA聚合酶閃亮登場，通過聚合游離的脫氧核糖核苷酸進行DNA鏈的延伸，在體外完成模板DNA的大量擴增，實現病毒核酸可被檢測的目的。 在RT-qPCR反應中常用的DNA聚合酶為熱啟動Taq DNA聚合酶，該類酶在常溫條件下無活性，只有經過熱啟動以后才具有聚合活性，可以最大限度地減少背景信號的生成，很好的解決了常規PCR反應中引物二聚體產生或錯配引起的非特異性擴增等問題。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動修飾方法主要有化學修飾、配體修飾和抗體修飾等，不同的熱啟動修飾方法原理如圖5所示。  

圖5.不同類型修飾熱啟動酶原理圖

韻邦制藥High Specific Taq DNA Polymerase, 5 U/μL（Cat#10726ES）是雙抗體進行雙封閉的熱啟動DNA聚合酶，具有高模板親和力。在常溫下不僅封閉了5'→3'聚合酶活性，同時也封閉了5'→3'核酸外切酶活性。在95℃條件下變性30sec其封閉抗體即可完全失活，釋放出DNA聚合酶活性和核酸外切酶活性。雙封閉特性不僅能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增，又能有效抑制探針降解產生的熒光信號下降，雙重保障使體外檢測試劑在運輸或室溫使用過程中更加穩定。

尿嘧啶DNA糖基化酶

在新冠核酸檢測過程中，操作環境中的氣溶膠污染是造成PCR結果假陽性最常見的因素，在擴增體系中加入UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶）則可有效消除PCR體系中混入的擴增殘留污染物（多以氣溶膠形式存在），保證擴增結果的準確性。UDG酶防污染原理如圖6所示。

圖6.UDG酶防污染原理示意圖